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RT-PCR試劑盒的PCR反應(yīng)及注意事項說明

更新時間:2022-06-27點擊次數(shù):936
   RT-PCR試劑盒合適的溫度通常在45-68℃之間(預(yù)備實驗可2℃間隔進(jìn)行)。另外,由于在60-68℃間,也有很高的活性,因此可在此溫度范圍內(nèi)設(shè)定溫度,進(jìn)行2 Step PCR。
  RT-PCR試劑盒是為兩步法RT-PCR一步實驗配制的,具有高靈敏度的RT-PCR反應(yīng)系統(tǒng),可以從極低量的總RNA或poly(A)+RNA合成一鏈cDNA。與PCR反應(yīng)相結(jié)合,可用于檢測稀有基因的表達(dá)、從極少量細(xì)胞中定量檢測特定mRNA的表達(dá)水平、克隆特定基因的cDNA片段等。合理配備與cDNA一鏈合成反應(yīng)相關(guān)的各種組分,該試劑盒有高效的逆轉(zhuǎn)錄酶活性,對后續(xù)的PCR或定量PCR實驗兼容性好,適合于各種PCR耐熱聚合酶。
  RT-PCR試劑盒試驗時進(jìn)行的PCR反應(yīng):
  1.吸取10%的一鏈反應(yīng)液(2μl)進(jìn)行PCR反應(yīng);即使加入更多量的一鏈反應(yīng)液也不能增加其擴增的產(chǎn)物量,反而可能會抑制正常的PCR反應(yīng);
  2.94℃加熱變性2min;
  3.設(shè)置15-40個PCR循環(huán)。退火與延伸條件依引物和模板而定。
  相關(guān)注意事項:
  1.用于cDNA合成反應(yīng)的溶液試劑盡量可能用DEPC進(jìn)行處理,并在高壓滅菌后使用。有些試劑不能高壓滅菌時,首先用經(jīng)過滅菌的器具、水等配制溶液后,再將溶液進(jìn)行過濾除菌處理。
  2.RNA樣品要避免基因組DNA污染。
  3.避免多次反復(fù)凍融RNA,使RNA保持在冰浴中處融化狀態(tài)。
  4.試劑盒的各組成成分應(yīng)在-20℃保存。
  5.cDNA產(chǎn)物應(yīng)置于-20℃保存。

TEL:021-61210612

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